高效液相色譜法(HPLC)具有高壓、高效、高速、高靈敏度、高選擇性等特點，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、環(huán)保、石化、食品、化工等行業(yè)，是現(xiàn)在分離分析的重要方法，本文著重介紹HPLC的工作原理、基本組成及高效液相色譜名詞術(shù)語，使新學(xué)者快速了解高效液相色譜知識，在日常操作中理論與實踐結(jié)合，確保HPLC的高效運行、快速分析。

　　1HPLC工作原理

　　100多年前俄國植物學(xué)家Tswett(茨維特) 他將植物色素的石油醚提取液倒入裝有碳酸鈣的直立玻璃管，再加入石油醚使其自由流下,結(jié)果色素中各組份互相分離形成各種不同顏色的譜帶，Tswett用希臘語chroma(色)和graphos(譜)描述他的實驗方法，即現(xiàn)在的Chromatography(色譜法)

　　色譜法是通過是利用混合物中各組份在不同的兩相中溶解、分配、吸附等化學(xué)作用性能的差異，當(dāng)兩相作相對運動時，使各組分在兩相中反復(fù)多次受到上述各作用力而達(dá)到相互分離，色譜法的本質(zhì)是分離分析方法。

　　色譜分離原理

　　兩相中的一相是固定的，叫作固定相(Stationary Phase)，一相是流動的，叫作流動相(Mobile Phase)，又叫洗脫劑。用液體作為流動相的，即為液相色譜(Liquid Chromatography, LC)。

　　HPLC為High Performance Liquid Chromatography的縮寫(High高、Performance性能、Liquid液體的、Performance 色譜)，是一種區(qū)別于經(jīng)典液相色譜，基于儀器方法的高效能分離手段，具有高壓、高效、高速、高靈敏度、高選擇性等特點。

　　2HPLC分類

　　按固定相和流動相的相對極性分為正相色譜(NormalPhaseChromatography)和反相色譜(Reversed Phase Chromatography)。

　　正想色譜：固定相的極性大于流動相。

　　反相色譜：固定相的極性小于流動相。

　　有機化合物極性是指分子間作用力(靜電引力、偶極力、色散力、氫鍵力)綜合表現(xiàn)的一種表述。

　　按分離過程的機理分為吸附色譜、分配色譜、離子交換色譜和體積排除色譜。

　　吸附色譜(Absorption Chromatography)：根據(jù)樣品組分對活性固定相表面吸附親和力的不同實現(xiàn)分離。

　　分配色譜(Partition Chromatography)：分離基于樣品組分在固定相和流動相中的溶解度(分配系數(shù))不同。

　　離子交換色譜(Ion Exchange Chromatography)：根據(jù)樣品組份離子交換親和力的差異分離,簡稱離子色譜(IC)。

　　體積排除色譜(Size Exclusion Chromatography)：分為GPC和GFC。

　　GPC(Gel Permeation Chromatography凝膠滲透色譜又稱尺寸排阻色譜)：固定相是疏水性凝膠,流動相是水或緩沖溶液-有機溶劑。

　　GFC(Gel Filtration Chromatography凝膠過濾色譜又稱水系凝膠色譜)：固定相是親水性凝膠,流動相是水或緩沖溶液。

　　3HPLC組成

　　HPLC由溶劑輸送系統(tǒng)(脫氣機、高壓泵等)、進(jìn)樣系統(tǒng)(定量泵、六通閥、定量環(huán)、進(jìn)樣針等)、分離系統(tǒng)(色譜柱等)、檢測系統(tǒng)(檢測器等)、記錄及數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)。

　　高壓輸液泵：將流動相在高壓下連續(xù)不斷地送入液路系統(tǒng)，具有有足夠的壓力，輸出流量恒定、可調(diào)，輸出壓力平穩(wěn)，泵室體積小，泵體抗腐蝕、耐酸等特點。

　　壓力平穩(wěn)、流速恒定是HPLC系統(tǒng)穩(wěn)定、重現(xiàn)性良好的前提條件，多數(shù)的HPLC故障、色譜數(shù)據(jù)異常均會表現(xiàn)出壓力異常，如偏高、偏低、波動大等，在日常使用中需要特別關(guān)注壓力變化。

　　在線脫氣機：四元低壓系統(tǒng)屬于泵前混合，由于在常壓下混合，極易產(chǎn)生氣泡，必須配有在線脫氣機，并要求流動相使用前進(jìn)行脫氣，流動相脫氣得目的如下：

　　使色譜泵輸液均勻準(zhǔn)確，減小脈動。 提高保留時間和色譜峰面積的重現(xiàn)性。 防止氣泡引起尖峰。 使基線穩(wěn)定，提高信噪比。 降低溶劑的紫外吸收本底。 減少死體積。 防止填料氧化。

　　進(jìn)樣系統(tǒng)：分為手動進(jìn)樣系統(tǒng)和自動進(jìn)樣系統(tǒng)， 主要由定量環(huán)、六通閥、進(jìn)樣針等部件組成。手動進(jìn)樣系統(tǒng)的定量環(huán)用于準(zhǔn)確定量，分為5μl、10μl、20μl等，需要根據(jù)不同進(jìn)樣量選擇合適的定量環(huán);自動進(jìn)樣系統(tǒng)儀器自帶定量環(huán)多為100μl，如進(jìn)樣量大于定量環(huán)體積需咨詢相應(yīng)儀器工程師更換定量環(huán)及計量泵等，六通閥是最理想的進(jìn)樣部件，由圓形密封墊(轉(zhuǎn)子)和固定底座(定子)組成，通過閥切換保證恒定的流速，下圖為六通閥不同狀態(tài)流路示意圖。

　　分析液相多數(shù)配自動進(jìn)樣系統(tǒng)，自動進(jìn)樣系統(tǒng)具有進(jìn)樣精度高、重現(xiàn)性好、可用于大量樣品分析等特點。

　　分離系統(tǒng)：包括色譜注、柱溫箱，連接管線等部件。

　　色譜柱一般用內(nèi)部拋光的不銹鋼制成。其內(nèi)徑為2～6mm，柱長為10～50cm，柱形多為直形，內(nèi)部充滿3～10 μm高效微粒固定相，根據(jù)不同的實驗需求需要選擇不同填料、不同規(guī)格的色譜柱。

　　柱溫箱：保證分離系統(tǒng)的溫度恒定，降低溫度波動對色譜基線、保留時間及色譜分離的影響，包括普通柱溫箱及帶有冷卻功能的柱溫箱，普通柱溫箱可以根據(jù)方法需求設(shè)定高于室溫的溫度(一般應(yīng)高于室溫5℃以上)，降低柱壓或是改善色譜分離，帶有冷卻功能的柱溫箱可以升高柱溫外,還可以設(shè)定低于室溫的溫度，預(yù)防穩(wěn)定性差樣品的降解，各品牌柱溫箱的控溫范圍略有差別，需要通過相應(yīng)產(chǎn)品說明書或咨詢客服了解。

　　需要特別注意的是有些品牌的柱溫箱是沒有配置預(yù)加熱模塊的，對于溫度敏感的樣品需要在柱前連接一段管線，對流動相進(jìn)行預(yù)加熱，管線長度及內(nèi)徑需適當(dāng)，盡量降低死體積。

　　檢測器：包括紫外可見吸收檢測器(UVD)、熒光檢測器(FD)、蒸發(fā)光檢測器(ELSD)、示差折光檢測器(RID)、電化學(xué)檢測器(ED)、化學(xué)發(fā)光檢測器(CD)、質(zhì)譜檢測器(MS)等類型，其技術(shù)要求為靈敏度高、噪音低、線形范圍寬、響應(yīng)快。

　　紫外可見吸收檢測器(UVD)：波長范圍190～800mm，190～400mm為紫外區(qū)域，氘燈，400～800mm為可見光區(qū)域，鎢燈。其特點為靈敏度高，最小檢測濃度10-9g/ml，線性范圍寬，對溫度和流速不敏感，可進(jìn)行梯度洗脫，應(yīng)用范圍廣。適用于帶有共軛基團的化合物，為最常用的檢測器。

　　熒光檢測器(FD)：氘燈作激發(fā)光源，波長范圍250～600nm。其特點為靈敏度更高，檢測限10-12～10-13g/ml(靈敏度比UV檢測器高2～3個數(shù)量級)，選擇性好，對溫度和流速不敏感，可進(jìn)行梯度洗脫，所需試樣量少，適于痕量分析，應(yīng)用于組分吸收一定波長紫外光后發(fā)射熒光的物質(zhì)，且熒光強度與濃度成正比。

　　蒸發(fā)光檢測器(ELSD)：是一種通用型的檢測器，可檢測揮發(fā)性低于流動相的任何樣品，而不需要樣品含有發(fā)色基團。蒸發(fā)光散射檢測器靈敏度比示差折光檢測器高，對溫度變化不敏感，基線穩(wěn)定，適合與梯度洗脫液相色譜聯(lián)用。被廣泛應(yīng)用于碳水化合物、類脂、脂肪酸和氨基酸、藥物以及聚合物等的檢測。其主要缺點為響應(yīng)值與濃度不呈線性，需取響應(yīng)值的對數(shù)與濃度計算線性。

　　示差折光檢測器(RID)：是一種連續(xù)檢測樣品流路與參比流路間液體折光指數(shù)差值的通用型檢測器，其優(yōu)點為對糖類檢測靈敏度較高，其檢測限可達(dá)10-8g/ml;穩(wěn)定性好，操作方便，缺點該檢測器對多數(shù)物質(zhì)的靈敏度低(約10-5g/ml),通常不用于痕量分析;受環(huán)境溫度、流動相組成等波動的影響較大，不適合梯度洗脫。

　　質(zhì)譜檢測器(MS):將樣品中的分析物電離，不同質(zhì)量離子在電場或磁場中，將按其質(zhì)量和所帶的電荷比(質(zhì)荷比，m/z)進(jìn)行的分離和排序，根據(jù)質(zhì)荷比的大小和相對強度形成規(guī)則的質(zhì)譜，從而對物質(zhì)進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒別和定量分析。質(zhì)譜分析具有靈敏度高，樣品用量少，分析速度快，分離和鑒定同時進(jìn)行等優(yōu)點，但流動相中不能含有無機鹽。

　　4HPLC名詞術(shù)語

　　色譜圖(Chromatogram) : 色譜柱流出物通過檢測器時所產(chǎn)生的響應(yīng)信號對時間的曲線圖,其縱坐標(biāo)為信號強度,橫坐標(biāo)為時間。

　　色譜峰(Peak):色譜柱流出組分通過檢測器時產(chǎn)生的響應(yīng)信號。

　　峰底(Peak Base):峰的起點與終點之間連接的直線。

　　峰高(Peak Height):峰最大值到峰底的距離。

　　峰面積(Peak Area):峰與峰底之間的面積,又稱響應(yīng)值。

　　基線(Baseline):在正常操作條件下,僅由流動相所產(chǎn)生的響應(yīng)信號。

　　基線飄移(Baseline Drift):基線隨時間定向的緩慢變化。

　　基線噪聲(N)N)(Baseline Noise):由各種因素所引起的基線波動。

　　譜帶擴展(Band Broadening):由于縱向擴散,傳質(zhì)阻力等因素的影響，使組分在色譜柱內(nèi)移動過程中譜帶寬度增加的現(xiàn)象。

　　保留時間(tR)(Retention time):組分從進(jìn)樣到出現(xiàn)峰最大值所需的時間。

　　死時間(t0)(Dead time):不被固定相滯留的組分,從進(jìn)樣到出現(xiàn)峰最大值所需的時間。

　　保留體積(VR)(Retention volume):組分從進(jìn)樣到出現(xiàn)峰最大值所需的流動相體積。

　　死體積(V0)(Dead volume):不被固定相滯留的組分,從進(jìn)樣到出現(xiàn)峰最大值所需的流動相體積。

　　等度：在整個運行過程中溶劑組成保持不變，如(60:40 甲醇/水)。

　　梯度：在運行過程中溶劑組成變化，漸變或臺階式變化，如100%的 H20/ 0%的MeOH到0%的H2O/100%的MeOH。

　　分離度：用于評價待測物質(zhì)與被分離物質(zhì)之間的分離程度，是衡量色譜系統(tǒng)分離效能的關(guān)鍵指標(biāo)。除另有規(guī)定外，待測物質(zhì)色譜峰與相鄰色譜峰之間的分離度應(yīng)大1.5 ,分離度的計算實例如下圖：

　　理論塔板數(shù)(N):分離效率的量度，用于評價色譜柱的分離效能。

　　拖尾因子：用于評價色譜峰的對稱性。

　　重復(fù)性：用于評價色譜系統(tǒng)連續(xù)進(jìn)樣時響應(yīng)值的重復(fù)性能。采用外標(biāo)法時，通常取各品種項下的對照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，除另有規(guī)定外，其峰面積測量值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)不大于2.0%;采用內(nèi)標(biāo)法時，通常配制相當(dāng)于80%、100和 120%的對照品溶液，加人規(guī)定量的內(nèi)標(biāo)溶液，配成3種不同濃度的溶液，分別至少進(jìn)樣2次，計算平均校正因子，其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)不大于2.0%。

　　5 HPLC日常操作注意事項

　　選擇流動相時應(yīng)注意的幾個問題：

　　盡量使用高純度試劑作流動相，防止微量雜質(zhì)長期累積損壞色譜柱和使檢測器噪聲增加。 避免流動相與固定相發(fā)生作用而使柱效下降或損壞柱子。 試樣在流動相中應(yīng)有適宜的溶解度，防止產(chǎn)生沉淀并在柱中沉積。 流動相同時還應(yīng)滿足檢測器的要求。當(dāng)使用紫外檢測器時，流動相不應(yīng)有較強的紫外吸收，一般檢測波長應(yīng)大于流動相的截止波長。

　　泵的維護(hù)保養(yǎng)：

　　防止任何固體微粒進(jìn)入泵體，否則會磨損柱塞、密封環(huán)缸體和單向閥，因此應(yīng)預(yù)先對流動相進(jìn)行過濾，可采用Millipore濾膜(0.22μm或 0.45μm )等過濾。泵的入口都應(yīng)該連接砂濾棒(或片)， 輸液泵的濾器應(yīng)經(jīng)常更換。 流動相不應(yīng)含有任何腐蝕性物質(zhì)， 含有緩沖液的流動相不應(yīng)保留在泵內(nèi)， 尤其是停泵過夜或更長時間。分析工作結(jié)束后必須用純水充分清洗后，再換成適合于色譜柱保存和有利于泵維護(hù)的溶劑(對于反相鍵合固定相，可以是甲醇或甲醇和水) 泵工作時要留心防止溶劑瓶內(nèi)的流動相用完，否則空泵運轉(zhuǎn)也會磨損柱塞、密封環(huán)或缸體，最終產(chǎn)生漏液。 輸液泵的工作壓力不要超過規(guī)定的最高壓力，否則會使高壓密封環(huán)變形，產(chǎn)生漏液。

　　紫外檢測器維護(hù)保養(yǎng)：

　　流通池進(jìn)入氣泡會干擾基線，并極難排出，應(yīng)使用充分脫氣的流動相，以減少氣泡的產(chǎn)生。 應(yīng)定期沖洗系統(tǒng)，避免流通池干涸。 檢測器中氘燈( 光源) 隨著使用時間的增加，氘燈強度降低，噪音會不斷增大，故分析前柱平衡得差不多時，再打開檢測器，分析工作結(jié)束及時關(guān)閉檢測器(頻繁開關(guān)檢測器也會縮短檢測器壽命，一般開啟間隔少于4小時，不建議關(guān)閉檢測器)。 塵埃在靜電的作用下容易覆蓋在光學(xué)元件上， 使光傳播效率降低，增加了光散射， 影響分析效果， 因此檢測器周圍的環(huán)境應(yīng)保持清潔。