在高效液相色譜(HPLC)系統中，色譜柱是核心部件之一。正確使用色譜柱，不僅能保證分析高效、靈敏地進行，而且對延長色譜柱的壽命、保持長期穩定的工作狀態具有重要的作用。由于色譜柱是有一定壽命的消耗性部件，價格昂貴，例如一根手性分析柱通常需要幾千元，甚至上萬元。因此，延長色譜柱的壽命對降低成本具有至關重要的意義。那么究竟怎樣規范地使用色譜柱才能保證其壽命呢?

　　使用前準備

　　1、使用前認真閱讀色譜柱的說明書，了解色譜柱的種類，選用合適的色譜柱。

　　在選用色譜柱時，應充分考慮所分析樣品的極性大小、化合物的種類數量、結構特征。根據化合物的性質，選擇合適的色譜柱和分析條件。不同類型的色譜柱使用的流動相不同，使用錯誤的流動相會降低柱效，損傷柱子。如分析極性較大的多糖類成分，應當采用親水性的反相填料。對于首次使用的色譜柱，還應按照廠家的出廠說明對色譜柱進行低流速的沖洗活化，活化后的色譜填料共價鍵鍵合力增強，柱效提高，壽命延長。

　　2、樣品的準備與預處理

　　我們的經驗是樣品純化得越干凈，色譜柱的使用壽命越長。許多樣品，尤其是生物樣品，組份非常復雜，對色譜柱的損傷性較大，不經預處理的樣品直接分析，會嚴重縮短色譜柱的使用壽命。因此，在樣品的準備時需對樣品進行預處理，包括準備溶劑的選擇、樣品過濾等。

　　2.1 制樣溶劑的選擇

　　制樣溶劑通常需要考慮樣品的溶解性、與流動相的相溶性、色譜填料的適用性等方面。這類溶劑需對樣品有較大的溶解性，而且與流動相溶，洗脫強度最好低于流動相或梯度洗脫中的起始流動相，以免影響樣品分離。目前許多手性色譜柱都禁止使用DMSO、四氫呋喃、氯仿等溶解樣品，這些溶劑會破壞固定相的結構，從而縮短色譜柱的使用壽命。此外，制樣溶劑還應與色譜系統其他部件如高壓泵、進樣器等相適用。

　　2.2 制樣溶劑過濾

　　在進樣前需過濾樣品溶液，如采用0.22μm的微孔濾膜除去不溶性微粒，以免堵塞柱頭濾片及柱內填充床。在條件允許的情況下，最好采用與色譜柱同種填料的固相萃取柱過濾進樣溶液，可以減少在色譜柱上死吸附的物質或易堵塞的大分子樣品。如生物樣品中的小極性的油脂類易于沉淀死吸附在C18反相色譜柱中，導致柱效降低、柱壓升高。采用SPE柱過濾后，可以有效減少在色譜柱中附著沉積的死吸附成分，保護色譜柱不被污染，保證其使用壽命。

　　2.3 其他，如溶液濃度、進樣量等

　　分析物的某些性質同樣能影響色譜柱的使用壽命。強酸、強堿性物質和蛋白質類生物大分子，它們能與固定相填料作用，或生成不可逆吸附層，改變填料表面特征，使色譜柱性能發生變化，最終導致分離失效。此外樣品的進樣量過大、超載都會影響色譜柱的分離性能和使用壽命。

　　使用過程準備

　　1、流動相的使用和分析方法的選擇

　　流動相的純度、溶劑的選擇、適當分析方法的使用與色譜柱的性能和壽命密切相關。

　　1.1 流動相的選擇

　　所選用的流動相應與色譜柱、待分析樣品相兼容，即樣品、樣品溶液和流動相是互溶的。流動相能夠溶解樣品，避免樣品沉淀析出;同時還要求流動相與樣品不發生化學反應，并且要求與色譜柱不能發生溶解或化學反應。

　　色譜分析應選擇色譜級的流動相。通常分析純的溶劑含有微量雜質，如有機溶劑中的聚乙二醇、無機鐵離子(Fe+)等，作為流動相大量使用后會引起色譜柱性能變化。最好是使用色譜純級或者更高純度的試劑，盡量降低溶劑中雜質帶來的損傷。

　　1.2 流動相過濾

　　使用色譜純試劑配制流動相，使用前需經0.45μm或者更小孔徑的濾膜過濾和超聲脫氣處理，減少灰塵、微生物等雜質堵塞色譜柱，尤其是水溶性流動相易引起微生物生長而造成色譜柱阻塞。流動相最好是現配現用，放置時間最好不要超過2天。

　　1.3 流動相的pH和緩沖鹽的選擇

　　極端pH的流動相會破壞填料內的共價鍵，“溶解”硅膠，使固定相流失，從而降低柱效，縮短使用壽命。以硅膠作基質的固定相一般要求pH在2.5~7范圍內使用。長期在pH>7或pH<2使用環境中，硅膠會逐漸溶解或者表面鍵合的官能團會逐漸流失。如果一定要用高或低pH的流動相，最好是選用相適應的色譜填料。

　　1.4 流速的控制

　　目前粒徑為1.8μm的UPLC的流速常設為0.3~0.5mL/min，粒徑為5μm的HPLC分析流速不大于1.5mL/min，粒徑為10μm半制備柱流速控制在3mL/min。流速過大，壓力升高，會引起色譜填料沖垮、塌陷。

　　2、色譜儀器的操作

　　每次開機使用分析儀器時，泵啟動太快，流速和柱壓的瞬間升高，柱床受到沖擊，引起紊亂，產生空隙，影響色譜柱的使用壽命。因此，在操作實驗開始時，應當將流速和柱壓逐漸增加。

　　3、保護柱的使用

　　“保護柱”是與所使用液相色譜柱相同填料的短型色譜柱，可以有效地阻攔容易損壞色譜柱的大分子和不溶性顆粒，過濾易沉著色譜柱上產生死吸附的物質，從而延長色譜柱使用壽命。

　　4、柱溫的控制

　　不同類型的色譜柱耐受的溫度各有差別。通常色譜柱溫維持在10～40℃之間，能夠充分、最優的發揮色譜柱的性能。超出色譜柱溫度范圍，尤其高于柱溫范圍，會增加對流動相中化學物質的吸附，引起色譜柱固定相結構的改變;此外，還可能引起柱床塌陷，改變峰形，降低柱效，產生不可逆性的損傷。

　　柱子使用一段時間后，總會有一些雜質累積在柱內，保留值較弱的物質，一般能快速從色譜柱沖洗出來，不產生干擾;中等保留強度的雜質能被緩慢沖洗出來，但對分析產生一定的干擾;強保留雜質通常聚集在柱頭或色譜柱中，難以被洗脫，甚至可能與填料發生相互作用，形成新的偽固定相，改變色譜柱的分離性能。通常表現為柱壓升高、基線不平、色譜雙峰、分離性能降低等。這些被污染的色譜柱經清洗后，可恢復部分甚至大部分離能力。因此使用后認真、定期清洗，不僅能延長色譜柱的使用壽命，節省資源，還能大大降低分析的成本。以我們常用的硅膠基質色譜柱為例，簡要闡述常用色譜柱的清洗與再生。

　　色譜柱使用后

　　1、色譜柱的清洗與再生

　　色譜柱的使用前后都需經較強的流動相沖洗。通常情況下，在使用硅膠、氧化鋁、極性鍵合相色譜柱時，每次用完后可先用二氯甲烷或正己烷等溶劑低流速長時間的沖洗;鍵合反相硅膠色譜柱、離子交換色譜柱和凝膠色譜柱可先用高比例的水(甲醇水混合溶劑)沖洗，再用100%甲醇沖洗。此外，色譜柱低流速的反相沖洗能夠有效除去堵塞在柱頭或篩板上的雜質，以及清洗聚集在柱頭部位的較強吸附物質。有些色譜柱在許多方法處理污染失效后，反過來使用，不僅柱壓降變小，柱效也可恢復如，延長了色譜柱的使用時間。

　　若上述常規清洗法無法清除污染物，則有必要采用更強的洗脫劑清洗，如反相材料的沖洗順序為：100%甲醇→100%乙腈→乙腈∶異丙醇(75∶25，V/V)→100%異丙醇。或者可以采用較低濃度的稀酸或稀堿可將有機溶劑不能洗脫的污染物除去。例如采用0.05mol/L的硫酸和流動相溶液沖洗色譜柱，可取得良好效果;或者采用1%氫氧化銨或50%二甲基甲酰胺水溶液，對聚集在柱頭的污染物具有良好的清洗效果。

　　如果分析時流動相中含有緩沖液(通常為鹽溶液)，沖洗時宜用水取代緩沖液與有機相混合沖洗色譜柱(20倍柱體積);再用100%有機溶劑沖洗。若直接用100%有機溶劑沖洗，可造成緩沖液沉積析出，從而損壞柱子品質。同樣的，若流動相中加入酸、堿溶液時，也應當按照上述方法，先采用高比例的水(水：甲醇10:90)沖洗20倍柱體積，防止強酸強堿溶液導致硅膠基質填料的溶解。

　　蛋白質對反相色譜柱的污染已成為常見問題，尤其在分離未經處理的動物組織等生物樣品。一般情況下，純有機溶劑如乙腈或甲醇不能很有效地清洗色譜柱，因而需要一些特殊的清洗方法。首先嘗試用高比例強極性溶劑的流動相進行沖洗，如乙腈∶異丙醇(1:2,V/V);或使用0.1%的三氟乙酸水溶液或者0.1%乙酸水溶液清洗。此外，還可以采用1%十二烷基硫酸鈉 (SDS)，然后用5%～95%乙腈/水(含0.1%TFA)梯度沖洗，去除蛋白污染物效果也較好。

　　若采用上述的條件清洗后色譜柱仍不能達到理想的效果，有必要將固定相從色譜柱內取出，進行清洗再生后重新裝填。具體操作是：將色譜固定相從色譜柱內打出后，用甲醇浮選，去除其中細小的破碎顆粒;然后用二甲基甲酰胺、丙酮、甲醇超聲清洗;最后干燥固定相，重新裝填色譜柱。經該方法處理的色譜柱，性能可得到顯著提高。

　　2、色譜柱的保存

　　色譜柱的保存應按照使用說明書中所指明的溶劑進行填充，盡可能的貯存于100%有機溶劑。色譜柱不能貯存在水或含水量高的溶劑中，會引起微生物的滋生，影響色譜柱壽命。如反相色譜柱長期不用，最好采用90%~95%的有機溶劑混合水溶液保存，防止色譜柱因密封不嚴造成色譜柱兩頭干涸、斷層引起的壽命縮短。

　　此外，色譜柱還應當輕拿輕放，避免劇烈碰撞引起的色譜柱填料產生塌陷、斷層，縮短使用壽命。